Coloração de Gram

                                                                    Microbiologia  

Prof. Dr. Luis Carlos F. Carvalho 

Aula prática: coloração de Gram 

Objetivo: 

Observar formas, disposição e comportamento tintorial das bactérias. Distinguir bactérias Gram- positivas das Gram-negativas. 

Princípio: 

O método de Gram permite classificar as bactérias em dois grandes grupos: as que retêm Violeta de genciana ( Gram-positiva ) e as que não retém o violeta genciana (Gram-negativa). Além do mais, é útil para determinar a forma (cocos e bacilos), e o arranjo das células após a divisão celular ( em forma de cacho, cadeias, sarcina etc., ). As células bacterianas são caracterizadas morfologicamente:

Quanto ao tamanho, as células bacterianas são sempre de dimensões microscópicas, o diâmetro da maioria delas varia de 0,2 a 1,5 m e comprimento de 1 a 6 m.

• Comportamento tintorial: Gram-positiva ou Gram-negativa

• Forma: cocos (esféricos), bacilos (cilíndricos) e espirilos (espiralados)

• Arranjo: Disposição das células entre si. Os cocos podem estar isolados, aos pares (diplococos),

agrupados em cachos (estafilococos), em cadeia (estreptococos). Os bacilos e espirilos se apresentam em geral como células isoladas porém, ocasionalmente pode-se observar bacilos aos pares (diplobacilos) ou em cadeia ( estreptobacilos ).

 Material: Reagentes de Gram: sol. cristal-violeta 2%; sol. aquosa de iodo (Lugol); mistura álcool-acetona; sol. alcoólica de safranina1, Lâminas: Suporte para lâminas; alça de platina; Bico de Bunsen; Microscópio; Óleo de Imersão. 

         Em 1884, o médico Dinamarquês Cristian Gram descobriu, empiricamente, ao corar cortes histológicos com violeta genciana, através do método de Ehrlich (1882), que as bactérias que eles continham não eram descoradas pelo álcool, se previamente tratadas com solução de iodo. Ele adicionou a este procedimento um contra-corante (safranina, fucsina básica, etc.,) e estabeleceu, a partir dai, uma metodologia de coloração diferencial.

        Ao longo destes anos, o mecanismo de coloração de Gram foi sobejamente estudado. E nesta medida, muitas modificações foram propostas, sem contudo, afetar substancialmente a idéia original.

        Os microrganismos respondem diferentemente ao método. Há os que retém o pigmento característico do corante (cristal violeta) em vista da formação de um complexo com a solução iodo-iodeto (lugol), apesar da lavagem com álcool ou acetona, motivando uma desidratação da parede celular, diminuição da porosidade e da permeabilidade. São os Gram-positivos. E há os que permitem a remoção do pigmento do corante pela lavagem com álcool ou acetona, em decorrência da extração de lipídios da parede, o que leva a um aumento da porosidade celular. São os Gram-negativos. Tratando, os dois grupos, com contra-corante (safranina ou fucsina básica) observa-se que as células do primeiro (Gram-positivos) não são afetadas e permanecem azuis ou violeta; enquanto que para o outro (Gram-negativos) as células absorvem o contra-corante, tornando-as vermelhas.

         A parede celular bacteriana apresenta particularidades na sua composição química. Este dado é absolutamente coincidente com a resposta à reação de Gram. A presença de maior teor de peptideoglicano nos Gram-positivos, tem sido apontado como fator determinante da retenção do complexo ao nível de parede. Tanto assim que os protoplastos, produzidos por ação de lisozima ou por efeito de penicilina sobre os Gram-positivos, não são capazes de reter o pigmento, após lavagem com álcool ou acetona. Portanto, a reação de Gram resulta essencialmente das interações do complexo, cristal violeta ou violeta de genciana e iodo, com o peptídeoglicano da parede celular, numa combinação ainda não de todo esclarecida, na qual a presença de ribonucleato de magnésio é mediadora da fixação do corante.

        A reação de Gram tem largo relacionamento com o estado fisiológico da célula. As culturas jovens respondem melhor à diferenciação tintorial. As culturas velhas de Gram-positivas podem se apresentar como Gram-variaável, pela perda da capacidade de retenção do corante.

        A coloração é hoje empregada com elevado significação taxonômica. Assim, são Gram-positivos quase todos os bacilos esporulados, móveis por flagelos peritríquios e a quase totalidade dos cocos. São Gram-negativos a quase totalidade dos bacilos não esporulados, móveis por flagelos peritríquios ou polares, e todas as espiroquetas, apenas para citar alguns exemplos.

Questão: 

1. A coloração de Gram possibilita caracterizar as bactérias quanto ao comportamento tintorial (Gram- positiva e Gram-negativa), morfologia (cocos, bacilos, espirilos) e arranjo (em cacho, em cadeias, aos pares). Qual o significado destas informações para a medicina?

Evidenciar a estrutura bacteriana, que vai determinar o tipo de bactéria para poder ajudar na identificação de uma possível infecção causada pela bactéria. 

2. A coloração de Gram exerce alguma importância em diagnósticos clínicos de bactérias isoladas de infecções humanas e animais? Citar pelo menos um exemplo.

Sim,  a coloração de Gram pode prever o tipo de bactéria que causa uma infecção, como pneumonia pneumocócica ou abscesso estafilocócico.

3. Empiricamente, Gram estabeleceu uma sequência para a aplicação dos corantes que integram a metodologia. Comentar os resultados possíveis de serem obtidos com as inversões da sequência referida no método.

Esquecer de descorar com álcool-acetonas, na qual as bactérias gram negativas ficarão coradas de roxo.

4. Sabe-se que se a parede celular é o sítio preferido pela fixação da reação de Gram. Fazer um esquema mostrando esta associação, para o caso típico de uma bactéria Gram-positiva.

As bactérias Gram-positivas retém o cristal violeta devido à presença de uma espessa camada de peptidoglicano (polímero constituído por açúcares e aminoácidos que originam uma espécie de malha na região exterior à membrana celular das bactérias) em suas paredes celulares.

5. Sendo o Gram um método de coloração diferencial, como esta reação pode ser empregada para a verificação do estado de pureza de uma determinada cultura?

A realização periódica do exame de uma cultura pura demonstra que todas as colônias apresentam a mesma característica de fixação do corante. 

6. Comente o efeito da penicilina sobre a parede celular bacteriana, correlacionando-o com a reação tintorial de Gram.

A penicilina atua inibindo a síntese da parede celular bacteriana provocando a morte da bactéria, ela é ativa contra cepas sensíveis de cocos gram positivos, porém facilmente hidrolisada pela penicilinase.

7. Comente a frase: “Uma bactéria Gram-negativa pode tornar-se Gram-positiva, dependendo do tempo de incubação da cultura, mas o inverso não é verdadeiro”. 

As bactérias gram- positivas não podem ser gram - negativas porque os protoplastos, produzidos por ação de lisozima ou por efeito de penicilina sobre os Gram-positivos, não são capazes de reter o pigmento, após lavagem com álcool ou acetona.